一、认识ddPCR

微微滴式数字PCR（Droplet Digital Polymerase Chain Reaction, ddPCR）是一种能够实现核酸“绝对定量”的精准检测技术，基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，使每个反应单元中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对定量。

ddPCR的基本原理图

二、ddPCR的优势

不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，ddPCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集来实现对待检靶分子的绝对定量，与上一代qPCR技术相比，ddPCR具有以下优势：

ddPCR和qPCR的比较

三、ddPCR助力多领域检测高质量发展

随着生命科学领域的发展，基因定量技术的重要性日益凸显。ddPCR技术作为基因定量工具的佼佼者，具有广泛的应用前景和巨大的发展潜力。近年来，国内外陆续发布了多个与ddPCR技术相关的标准法规及相关文献，涉及到核酸分子检测、分子诊断、肿瘤学等多个领域，为生命科学领域的基因检测、临床研究及应用提供了全新的技术思路与手段。

1. ddPCR在农业食品检测领域的应用

为了有效控制食源微生物的污染，保障食品质量与安全，2021年，中华人民共和国海关总署发布了《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5364—2021—出口食品中致病菌检测方法—微滴式数字PCR法》，其中详细规定了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等常见致病菌的ddPCR检测方法。

张明明^[1]等人为实现食源性致病菌基因组拷贝数的快速绝对定量检测，在其基础上建立了可在同一反应体系中同时、快速、绝对定量检测伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系，对食源性致病菌的无增菌绝对定量检测具有指导意义。

2. ddPCR在分子体外诊断领域的应用

2016年，国际标准化组织（ISO）发布了《ISO/TS 35630-1：2016：分子诊断检测》的国际标准，详细说明了ddPCR分子体外诊断检测实验的关键步骤和数据分析过程。

近年来，ddPCR技术在分子体外诊断领域中发展迅速。在对95例非小细胞肺癌（NSCLC）的研究中，Li Xiaoyan^[2]等人对患者胸水cfDNA样本进行分析时，对比了ddPCR、ARMS和直接测序法的检测结果，发现ddPCR在检测表皮生长因子受体（EGFR）基因突变方面具有更高的灵敏度和特异性，与直接测序相比提升了75.4%的突变检出率，有助于医生提供更准确的诊断和治疗方案，对改善NSCLC患者的治疗和预后方案的有效性具有重要意义，也为其他疾病的研究和治疗提供了新思路。

3. ddPCR在质粒拷贝数检测中的应用

重组质粒的拷贝数可以影响细菌的表型和基因表达，因此对质粒拷贝数的精确测定对于理解基因表达和表型变化具有重要意义。2018年，美国材料与试验协会（ASTM）发布了《ASTM E3128-2018使用数字PCR进行基因组DNA拷贝数变化的绝对测定》的标准方法，但至今仍未制定关于使用ddPCR技术检测细菌内重组质粒拷贝数的标准规范。

目前使用qPCR定量细菌中的重组质粒拷贝数是较普遍的方法，缺点在于其准确性很大程度上取决于标准品的质量。然而，Magdalena Plotka^[3]等人发现使用单色ddPCR（EvaGreen染料）可以更准确、精密地定量细菌中低拷贝重组质粒，该方法可以进一步优化用于其他选择标记（如编码氯霉素或四环素抗性的基因）和不同的细菌宿主，未来有望应用于其他与质粒拷贝数检测相关的研究。

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